在玉米育種特別是雜交種的選育過程中，雜交種親本的遺傳特性非常重要，它是雜交種的鑒定和注冊的基礎(chǔ)。育種家們準(zhǔn)確的掌握親本自交系的遺傳特性，結(jié)合已有的分子標(biāo)記指紋圖譜，有利于雜交育種。獲取雜交種和其親本的分子指紋圖譜的一般技術(shù)是首先知道雜交種的親本，然后通過實(shí)驗(yàn)建立分子指紋圖譜（李新海等，2003）（吳渝生等，2003）。但是在新品種的指紋收集和在玉米品種純度鑒定中，出于商業(yè)考慮，雜交種擁有者提供假親本或者是不提供親本資料信息，這給我們實(shí)驗(yàn)人員帶來了很多的困難，然而我們從雜交種F1代種子可以得到親本自交系遺傳特性（Wang J等，2002）。種皮組織的遺傳物質(zhì)來自于母本（Poething R S等，1982），F(xiàn)1代雜交種的種胚及其種皮的DNA通過SSR（Simple sequence repeats）分子標(biāo)記可以得出雜交種母本的指紋圖譜，結(jié)合雜交種DNA的SSR標(biāo)記結(jié)果就可以獲得雜交組合父母本的全部DNA指紋圖譜了。本實(shí)驗(yàn)用13個(gè)自交系及其通過正反交組配的20個(gè)雜交組合，分別分離并提取種皮DNA及種胚DNA，每個(gè)組合選取其特異的10對SSR分子標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記分析，從分子水平上探討F1代種子中所蘊(yùn)含的分子信息，揭示玉米雜交種種皮遺傳信息量與母本遺傳信息量的關(guān)系，研究結(jié)果將為實(shí)施玉米種子質(zhì)量監(jiān)控和知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供技術(shù)支撐。
1. 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
選用玉米育種中常用自交系13份，2005年冬在海南組配雜交種（表1）
表1 實(shí)驗(yàn)材料
編號 正交組合 反交組合
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 沈137×K12
掖478×丹340
吉853×Mo17
P138×綜31
444×Mo17
吉846×丹340
黃早4×Mo17
鄭58×昌7-2
E28×沈5003
齊319×魯9801 K12×沈137
丹340×掖478
Mo17×吉853
綜31×P138
Mo17×444
丹340×吉846
Mo17×黃早4
昌7-2×鄭58
沈5003×E28
魯9801×齊319

1.2 研究方法
1.2.1 DNA提取
親本自交系以及雜交種DNA提取：種小苗，每個(gè)樣品混合取10個(gè)單株葉片，用改進(jìn)的CTAB法提取DNA（顏廷進(jìn)等，2003）。
雜交種種皮DNA提取：將20粒種子放入2.5%的NaOH溶液中1分鐘，取出蒸餾水沖洗3-5分鐘，用鑷子小心剝下種皮放入蒸餾水中清洗一次，晾干，液氮研磨，收集種皮粉末放入2.0ml的離心管中，加入700µl的65℃水浴預(yù)熱的CTAB提取液（100mM Tris-7.5，700mMNaCL，50mM EDTA （8.0），1% CTAB）和20µl的β-巰基乙醇，振蕩混勻，再加入700ml氯仿異戊醇（24：1），均與振蕩10min，8000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中，加入800µl冰凍無水乙醇靜置沉淀DNA，10000r/min離心5分鐘，倒掉上清液，加入1ml70%乙醇，10000r/min離心1min，倒掉上清液，再加1ml70%乙醇清洗，去上清液，晾干，加入80µl雙蒸水溶解DNA。
1.2.2 SSR引物選擇
按照本實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和發(fā)表的文章（肖木輯等，2006）（李新海等，2003），依據(jù)條帶清晰，父母本多態(tài)性高，且在染色體上均勻分布等特點(diǎn)，每個(gè)正反交組合選出10對SSR引物（表2）。
1.2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)按照以下反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增：在10µl反應(yīng)體系中，包括10 mmol/LTris- HCl，50 mmol/L KCl，0.001% Gelatin，1.5 mmol/L，MgCl2，4種dNTP 各0.25mmol/L，0.3mmol/L SSR 引物，2UTaq 酶，25ngDNA模板。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃模板DNA預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán)；94℃模板DNA變性45s，60℃退火45s，72℃引物沿模板延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；zui后在72℃延伸5min，降至4℃取出后變性。
電泳、銀染：，用4.5% 聚丙烯酰胺變性凝膠電泳，使用Bio-RAD公司的電泳設(shè)備，38cm×30cm×0.4mm測序膠板，恒定功率60W，電泳45min；膠板放入10%酒精和0.5%醋酸溶液7min，蒸餾水2min，0.1%AgNO3溶液10min，蒸餾水2s，1.5%NaOH溶液，直至帶型清晰，蒸餾水漂洗3min。
表2 10對正反交組合特異性引物
編號 引物
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 phi109275、phi029、phi034、phi076、phi123、phi423796、phi114、phi014、phi065、umc1196
phi011、phi127、phi029、phi072、phi024、phi078、phi116、phi015、phi108411、umc1196
phi064、phi083、umc1555、phi072、phi024、phi123、phi057、phi015、phi444880、umc1196
phi056、phi083、phi047、phi076、phi024、phi123、phi112、phi080、umc1277、umc1061
phi056、phi127、phi029、phi102228、phi024、phi112、phi057、phi015、umc1277、umc1061
phi109275、phi127、phi046、phi047、phi034、phi024、phi014、phi065、phi050、phi047
phi064、phi127、phi029、phi374118、phi109188、phi123、phi116、umc1161、phi108411、umc1196
phi011、umc1555、phi046、phi072、phi024、phi123、umc1545、phi015、phi065、umc1196
phi011、umc1124、phi046、phi034、phi076、phi024、phi116、phi015、phi065、phi063
phi109275、phi374118、phi072、phi085、phi089、phi057、phi112、phi080、phi233376、umc1061

2. 結(jié)果與分析
2.1 種皮提取DNA

根據(jù)熱脹冷縮的原理，先將種子放在清水里浸泡12小時(shí)，然后將種子放在通風(fēng)的地方半小時(shí)，種子干了之后用刀片將臍切掉，以防胚組織將種皮污染。用鑷子將種皮剝下，然后用潔凈的*柄和吸水紙將種皮上面的一些雜質(zhì)去掉，這種方法剝離種皮速度相對較慢一些。另外一種方法是用2.5%的NaOH溶液進(jìn)行浸泡1min，然后用雙蒸水沖洗，可以明顯的看到種皮皺褶，基本上和其他組織分離，皺褶的種皮上肉眼看上去比較干凈，，只要用鑷子就很容易剝離下來，剝離種皮的速度相對較快。
表3 實(shí)驗(yàn)記錄
　 正交母本 正交種皮 反交母本 反交種皮 雜交種胚 　 正交母本 正交種皮 反交母本 反交種皮 雜交種胚組合1 沈137×K12 組合6 吉853×丹340
1 A A B B AB 1 A A B B AB
2 A A B B AB 2 A A B B AB
3 A A B B AB 3 A A B B AB
4 A A B B AB 4 A A B B AB
5 A A B B AB 5 A A B B AB
6 A A B B AB 6 A A B B AB
7 A A B AB AB 7 A A B B AB
8 A A B B AB 8 A A B B AB
9 A A B B AB 9 A A B B AB
10 A A B B AB 10 A A B B AB
組合2 掖478×丹340 組合7 黃早4×Mo17
1 A A B B AB 1 A A B B AB
2 A A B B AB 2 A A B B AB
3 A A B B AB 3 A A B B AB
4 A A B AB AB 4 A A B B AB
5 A A B B AB 5 A A B B AB
6 A A B B AB 6 A A B B AB
7 A A B B AB 7 A A B B AB
8 A A B B AB 8 A A B B AB
9 A A B AB AB 9 A A B B AB
10 A A B B AB 10 A A B B AB
組合3 吉853×Mo17 組合8 鄭58×昌7-2
1 A A B B AB 1 A A B B AB
2 A A B B AB 2 A A B B AB
3 A A B B AB 3 A A B B AB
4 A A B B AB 4 A A B B AB
5 A A B B AB 5 A A B B AB
6 A A B B AB 6 A A B B AB
7 A A B B AB 7 A A B B AB
8 A A B B AB 8 A A B AB AB
9 A A B B AB 9 A A B B AB
10 A A B B AB 10 A A B B AB
組合4 P138×綜31 組合9 E28×沈5003
1 A A B B AB 1 A A B B AB
2 A A B B AB 2 A A B B AB
3 A A B B AB 3 A A B B AB
4 A A B B AB 4 A A B B AB
5 A A B B AB 5 A A B B AB
6 A A B B AB 6 A A B B AB
7 A A B B AB 7 A A B B AB
8 A A B B AB 8 A A B B AB
9 A A B B AB 9 A A B B AB
10 A A B B AB 10 A A B B AB
組合5 444×Mo17 組合10 齊319×魯9801
1 A A B B AB 1 A A B B AB
2 A A B B AB 2 A A B B AB
3 A AB B B AB 3 A A B B AB
4 A A B B AB 4 A A B B AB
5 A A B B AB 5 A A B B AB
6 A A B B AB 6 A A B B AB
7 A A B B AB 7 A A B B AB
8 A A B B AB 8 A A B B AB
9 A A B B AB 9 A A B B AB
10 A A B B AB 10 A A B B AB

2.2 DNA分子標(biāo)記結(jié)果分析
雜交種DNA擴(kuò)增產(chǎn)物SSR標(biāo)記的膠板照片如圖1所示，其中1、2、3、4、5分別是正交組合母本、正交雜交種種皮、反交組合母本、反交種種皮和雜交種胚五種來源的DNA分子標(biāo)記圖。從圖片中可以看出正交組合母本和正交雜交種種皮DNA擴(kuò)增帶型的指紋一致，反交組合母本和反交種種皮DNA擴(kuò)增帶型的指紋一致，雜交種胚DNA擴(kuò)增帶型為正、反交母本的雜合帶型，也就驗(yàn)證了雜交F1代種胚DNA來自父母本，種皮DNA來自母本。

注：每個(gè)引物標(biāo)記中1、2、3、4、5分別是正交組合母本、正交雜交種種皮、反交組合母本、反交種種皮和雜交種胚五種來源的DNA分子擴(kuò)增帶型
圖1 黃早4×Mo17正反交組合分子標(biāo)記圖
統(tǒng)計(jì)10個(gè)正反交雜交組合和每個(gè)組合的10對引物的分子標(biāo)記結(jié)果見表3. 結(jié)果表明：97.5%的種皮DNASSR標(biāo)記表現(xiàn)為純合帶型，與母本相同，2.5%的表現(xiàn)為雜合性條帶，與雜交種相同。如：組合沈137×K12，引物phi114標(biāo)記結(jié)果為反交雜交種種皮DNA擴(kuò)增帶型與雜交種相同，其余的種皮DNA擴(kuò)增帶型與母本相同；組合掖478×丹340，phi072，phi108411標(biāo)記的結(jié)果也都是反交雜交種種皮DNA擴(kuò)增帶型與雜交種相同，其余的種皮DNA擴(kuò)增帶型與母本相同。組合444×Mo17，phi029標(biāo)記結(jié)果是正交雜交種種皮DNA擴(kuò)增帶型與雜交種相同，其余的種皮DNA擴(kuò)增帶型與母本相同。組合鄭58×昌7-2，phi015標(biāo)記結(jié)果是反交雜交種種皮DNA擴(kuò)增帶型與雜交種相同，其余的種皮DNA擴(kuò)增帶型與母本相同.其他六個(gè)正反交組合中的種皮DNA擴(kuò)增帶型都與母本相同。
對于這幾個(gè)種皮表現(xiàn)為雜合帶型的種子，為了排除實(shí)驗(yàn)人為誤差（DNA在提取時(shí)和提取后被污染等人為操作原因），又進(jìn)行了三次重復(fù)DNA提取實(shí)驗(yàn)，將三次實(shí)驗(yàn)提取的DNA用組合中相同的引物進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記結(jié)果仍然為雜合帶型。
3. 討論
以種皮組織作為一種鑒定工具在以前就應(yīng)？開始了，開始是以種皮的顏色、厚度、種皮的表面形態(tài)和種皮細(xì)胞的大小作為一種鑒定標(biāo)準(zhǔn)（Pfahler P L等,1975），這只是從形態(tài)學(xué)上進(jìn)行描述，受環(huán)境條件及其他因素影響比較大。隨著分子標(biāo)記的出現(xiàn)及其發(fā)展，利用RAPD（Randomly Amplified Polymorphic

DNA）分析玉米種皮和母本的遺傳關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者之間有一些差異，分析認(rèn)為造成差異的原因是由于RAPD的實(shí)驗(yàn)過程中使得種皮的DNA發(fā)生了一定的改變（Stojsin D等，1996）。SSR分子標(biāo)記以多態(tài)性高，重復(fù)性好，多位點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)簡單等特點(diǎn)更加優(yōu)于RAPD技術(shù)用于研究種皮和母本之間的遺傳關(guān)系（Wang J等，2002）。
此種鑒定方法比較關(guān)鍵的地方就是玉米種皮的順利剝離及其高純度的保證（趙久然等，2004）。幾種剝離方法中，都得注意要將玉米種子的臍先除掉，然后在將種皮剝離，防止種皮在剝離的時(shí)候通過種臍被種胚污染。本實(shí)驗(yàn)技術(shù)應(yīng)用于實(shí)際操作的過程中引物的使用非常關(guān)鍵，選擇的引物必須能使雜交種的父母本表現(xiàn)出多態(tài)性。而實(shí)際中我們可能沒有直接來自父母本的DNA，所以很難篩選多態(tài)性引物，在沒有其親本的情況下，我們利用雜交種種皮DNA作為母本DNA，結(jié)合雜交種種胚的DNA，用SSR引物進(jìn)行標(biāo)記，雜交種DNA表現(xiàn)為雜合，種皮DNA的帶與雜合帶型的一條相同，此引物就可以作為獲得雜交種父母本指紋圖的候選引物了。同時(shí)我們可以利用李曉輝等（2005）公布的50對多態(tài)性高，擴(kuò)增條帶清晰，分辨率高，擴(kuò)增穩(wěn)定的候選引物和10對核心引物進(jìn)行多態(tài)性引物篩選，獲得多態(tài)性引物。
10個(gè)雜交組合獲得了20個(gè)雜交種，每個(gè)組合用10對引物建立成20×10的SSR分子標(biāo)記結(jié)構(gòu)，所有種皮與母本的比較次數(shù)總共是200次，但是有5次的結(jié)果和其他的不同，種皮表現(xiàn)出與雜交種遺傳信息一致。出現(xiàn)這種情況可能有幾個(gè)方面的原因：在進(jìn)行雜交種組配的時(shí)候母本在某個(gè)位點(diǎn)還處于雜合狀態(tài)；或者在玉米受精卵發(fā)育的過程中，受精卵細(xì)胞分化出的極少數(shù)的一部分細(xì)胞與體細(xì)胞結(jié)合在一起發(fā)育成玉米種皮，導(dǎo)致玉米種皮DNA與種胚相同，表現(xiàn)出雜合狀態(tài)；或是雜交組合母本在特定標(biāo)記位點(diǎn)發(fā)生了突變，但是這種情況的出現(xiàn)不能否認(rèn)種皮DNA來自母本。因此通過雜交種和種皮就能得到母本和雜交種的DNA指紋圖譜，結(jié)合正反交組合就能夠獲得雜交種及其親本的全部DNA指紋圖譜了。
DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫是玉米雜交種分子鑒定的基礎(chǔ)，隨著新雜交種的不斷出現(xiàn)，可能會使已構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫產(chǎn)生局限性，這就需要不斷擴(kuò)充數(shù)據(jù)庫的規(guī)模和在更大量數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上重新計(jì)算等位基因頻率，從而使數(shù)據(jù)庫更具代表性和性（李曉輝等，2005），但是在新品種的指紋收集和在玉米品種純度鑒定中，需要進(jìn)檢方在提供雜交種子的同時(shí)提供一定的母本種子，以母本種子為參照，鑒別樣品中的自交苗數(shù)。出于品種保護(hù)及商品秘密，送檢方不愿或無法提供親本種子，那么給檢測工作帶來很大的難度（趙久然等，2004）。本研究的實(shí)驗(yàn)技術(shù)可以解決這個(gè)問題，雜交種或者正反交雜交種種皮及種胚DNA為雜交種及其親本提供*的DNA指紋圖譜，完善和擴(kuò)充玉米DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，同時(shí)也為不斷壯大的玉米雜交種建立新的DNA指紋文庫提供更便捷的方法。
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